ISOLASI DAN IDENTIFIKASI FUNGI PENYEBAB MIKOSIS OPPORTUNISTIK

Hikmah Putri, Rizqy Fauziah, Yuni Trisna Lestari

Isolasi Dan Identifikasi Fungi Penyebab Mikosis Opportunistik

Mikosis opportunistik adalah infeksi yang disebabkan oleh organisme yang biasanya tidak menyebabkan penyakit pada orang dengan sistem kekebalan tubuh yang normal, tetapi dapat menyerang orang dengan sistem kekebalan tubuh yang buruk.

Pasien dengan gangguan pertahanan pejamu, rentan terhadap fungi yang terdapat di mana-mana, tetapi orang sehat yang terpajan biasanya resisten. Pada banyak kasus, tipe fungi dan perjalanan penyakit infeksi mikotik ditentukan oleh keadaan predisposisi pejamu. Sebagai anggota flora mikroba normal, kandida dan fungi serumpun merupakan oportunis endogen. Mikosis oportunistik lain disebabkan oleh fungi eksogen yang secara umum terdapat di tanah, air dan udara. (Mitchell, 2007)

Fungi yang paling sering diisolasi dari pasien immunocompromised adalah saprophytic (yaitu dari lingkungan) atau endogen (komensal). Spesies yang paling umum adalah spesies Candida, spesies Aspergillus, dan spesies Mucor.

Bila fungi diisolasi dari pasien yang immunocompromised, dokter yang merawat harus membedakan antara:

• Kolonisasi (yang tidak menjadi perhatian utama)

• Transient fungemia (sering melibatkan C. albicans)

• Infeksi sistemik

Gambaran Umum Hubungan Antara Fungi dan Kondisi Penyakit

Fungi Penyebab Mikosis Opportunistik

1. Candida albicans

Candida merupakan fungi golongan khamir penyebab tersering infeksi fungi opportunistik diseluruh dunia. Candida biasanya berkolonisasi di membran mukosa dan kulit manusia serta merupakan flora normal pada kulit, membran mukosa, saluran cerna, dan vagina. Selain dapat menjadi patogen dan membentuk kolonisasi, biasanya Candida juga ditemukan dalam lingkungan, seperti daun, bunga, air dan tanah. Fungi ini berbentuk dimorfik yaitu berbentuk hifa/pseudohifa ditemukan pada penyakit atau bentuk patogen dan berbentuk ragi/yeast merupakan bentuk istirahat sebagai saprofit. C. albicans bersifat dimorfik; selain ragi dan pseudohifa, spesies tersebut juga dapat menghasilkan hifa sejati. Penyebab terbanyak dalam kandidiasis adalah Candida albicans, spesies dengan patogenitas paling tinggi.

2. Aspergillus sp

Aspergilus adalah fungi opportunistik patogen yang dapat menginfeksi manusia. Aspergilosis merupakan infeksi yang disebabkan oleh fungi Aspergillus. Fungi ini terdapat di alam bebas, sehingga sporanya sering diisolasi dari udara. Cara infeksi tergantung lokasi yang diinfeksi ada beberapa bentuk yaitu : Aspergilosis kulit, Aspergilosis sinus, Aspergilosis paru, Aspergilosis sistemik.

Aspergillus sp tumbuh cepat, menghasilkan hifa aerial yang memperlihatkan ciri khas struktur konidia, konidiofora panjang dengan vesikel di terminal, tempat fialid menghasilkan rantai–rantai basipetal konidia. Spesies ini diidentifikasi menurut perbedaan morfologi dalam struktur–struktur tersebut, termasuk ukuran, bentuk, tekstur, dan warna konidia.

Aspergillus adalah saprofit yang sangat mudah ditemukan di sekitar kehidupan manusia dan terdiri atas sekelompok spesies berbeda. Spesies yang kerap menyebabkan penyakit adalah Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger dan Aspergillus terreus, spesies yang paling patogen adalah A. fumigatus mampu tumbuh pada suhu 37oC bahkan sampai suhu 50oC.

Aspergillus adalah fungi saprofit yang sehari-hari konidianya sangat mudah terhirup ke dalam saluran napas tanpa menyebabkan kelainan. Konidia yang masuk akan dikeluarkan oleh pergerakan silia epitel torak atau dihancurkan oleh imunitas tubuh. Diperlukan faktor resiko yang mengubah pertahanan tubuh dan memungkinkan jamur menyebabkan infeksi. Tempat predileksi utama aspergilosis adalah paru-paru akibat inhalasi konidia. Kelainan yang disebabkan Aspergillus contohnya aspergilosis invasif.

3. Cryptococcus neofarmans

Kriptokokosis adalah penyakit oportunis sistemik yang disebabkan oleh fungi Cryptococcus neoformans yang dapat menimbulkan kelainan pada kulit, paru dan meningtis. Pada medium SDA tumbuh koloni fungi yang berwarna kuning tua yang tumbuh cepat pada temperatur 37oC.

Di dalam kultur, Cryptococcus sp. menghasilkan koloni mukoid keputihan dalam 2–3 hari. Secara mikroskopis, dalam bahan kultur atau klinis, sel fungi yang bulat dan bertunas (diameter 5-10 mikron) dikelilingi oleh kapsul tebal yang tidak terwarnai. Semua spesies Cryptococcus, termasuk beberapa spesies nonpatogen, terbungkus di dalam kapsul dan mengandung urease. Akan tetapi, Cryptococcus neofarmans dan Cryptococcus gatti berbeda dengan spesies nonpatogen karena mampu tumbuh di suhu 37oC dan menghasilkan laktase, suatu fenol oksidase yang mengkatalisasi pembentukan melanin dari substrat fenol yang sesuai. Baik kapsul dan laktase merupakan faktor virulensi yang sudah menjadi ciri yang jelas. Isolat klinis dikenali dengan terdapatnya produksi laktase atau pola spesifik asimilasi karbohidrat. Reproduksi seksual dapat terlihat di laboratorium, dan perkawinan yang sukses akan menghasilkan miselium dan basidiospora.

4. Zigomikosis

Zigomikosis adalah infeksi yang disebabkan oleh fungi golongan Zygonicota. Pada umumnya kasus zigomikosis pada manusia dihubungkan dengan kondisi imunologinya. Fungi ini merupakan penyebab infeksi oportunistik yang dapat memberi gambaran klinis bermacam-macam tergantung pada fakor predisposisinya. Zigomikosis biasanya disebabkan oleh fungi ordo Mucorales, misalnya Mucor sp.

Isolasi dan Identifikasi

• Isolasi Candida spp

Sampel

Spesimen didapat tergantung di mana fungi ini menginfeksi, meliputi kandidiasis superfisial (kulit dan kuku), kandidiasis sistemik (saluran pernafasan, saluran cerna) dan kandidiasis vagina. Contoh spesimen : kerokan kulit dan kuku, apus vagina, darah, cairan spinal, biopsi jaringan, urine dan materi dari kateter intravena yang dilepas.

Contoh pengambilan sample pada kulit

- Pisau scalpel steril disiapkan

- Kulit yang akan dikerok dibersihkan dengan kapas beralkohol, dibiarkan mengering

- Sementara kulit mengering, media yang akan digunakan disiapkan

- No. lab, nama pasien, dan tanggal pengambilan sampel ditulis

- Bagian kulit yang terinfeksi dikerok

- Kerokan yang sudah terkumpul sebagian ditabur (ditanam) dalam media yang sudah disiapkan, sebagian dibuat preparat KOH.

Pemeriksaan Langsung

Biopsi jaringan, cairan spinal yang disentrifugasi, dan spesimen lain dapat diperiksa dalam apusan yang dipulas Gram atau sediaan histopatologis untuk melihat adanya pseudohifa dan sel tunas. Kerokan kulit pertama–tama ditempatkan di dalam tetesan kalium hidroksida (KOH) 10%.

Biakan

Semua spesimen dibiakkan pada medium fungi pada suhu ruang atau pada suhu 37oC. Koloni fungi kemudian diperiksa untuk mencari keberadaan pseudohifa. C. albicans dikenali melalui pembentukan tabung tunas (serm tube) atau klamidiospora.

• Identifikasi Candida spp

 Candida albicans

Makroskopik

Pada agar SDA dengan suhu 25oC, dapat tumbuh koloni fungi berwarna putih hingga cream, bentuk bulat, menonjol konsistensi lunak dan halus hingga berkerut. Isolasi ini dapat hidup pada suhu 42oC dan pada media yang mengandung cyclohexumide.

Candida albicans pada media SDA

Mikroskopik

Pada inkubasi agar cornmeal selama 72 jam dengan suhu 25oC, ditemukan banyak cabang pseudohifa dan hifa sejati dengan blastokonidia. Blastokonidia berbentuk seperti anggur dan terdapat disepanjang hifa.

 Candida tropicalis

Makroskopik

Pada medium SDA, koloni berwarna krem dengan pinggir miselium yang tipis dan juga memproduksi film dengan permukaan yang tipis serta gelembung pada saat dibiakkan pada Sabouraud broth.

Makroskopis Candida tropicalis

Mikroskopik

Pada agar cornmeal tween 80 setelah diinkubasi selama 72 jam pada suhu 25oC. Candida tropicalis dapat memproduksi blastospora yang berlokasi sepanjang pseudohifa. Blastospora dapat terlihat sendiri–sendiri atau berkelompok. Pseudohifa bercabang sangat banyak dan juga dapat memproduksi hifa sejati.

Mikroskopis Candida tropicalis

• Isolasi Aspergilus spp

Sampel

Sampel pada aspergilosis dapat berupa sputum, bilasan bronkus, dan usap hidung/mulut.

Pemeriksaan Langsung

Pemeriksaan langsung dengan KOH 10-20%. Saat ini beberapa rumah sakit terkemuka di dunia mulai menerapkan pemeriksaan berbasis molekular (PCR) untuk diagnosis aspergilosis. Diagnosis ditegakkan berdasarkan gabungan gejala klinis, faktor resiko, gambaran CT scan paru dan hasil pemeriksaan laboratorium.

Biakan

Semua spesimen dibiakkan pada medium fungi pada suhu ruang atau pada suhu 37oC kemudian diperiksa untuk mencari keberadaan pseudohifa.

• Identifikasi Aspergillus spp

 Aspergilus flavus

Makroskopik

Pada agar Czapek Dox, koloni menunjukkan ciri khas pigmentasi permukaan biru kehijauan dengan permukaan seperti suede yang terdiri dari padat seperti konidiaspora. Kepala konidri adalah biasanya kolumnar (sampai 400 x 50 μm tapi sering jauh lebih pendek dan lebih kecil) dan uniseriate conidiophore stipes pendek, berdinding halus dan berbentuk kerucut vesikula terminal yang mendukung satu deretan phialides pada dua pertiga bagian atas dari vesikel konidia diproduksi disuksesi basipetal membentuk rantai panjang dan bersifat globosa menjadi subglobose (diameter 2.5-3.0 μm), hijau dan berdinding kasar untuk melakukan echinulate. Catatan: Spesies ini bersifat termotolerant dan tumbuh pada suhu naik ke 55oC.

Makroskopik Aspergillus flavus

Mikroskopik

Hifa Aspergillus flavus berupa septa hialin. Konidiofora biasanya kasar, tidak berwarna berukuran 800 µm x 15-20 µm. spesies ini merupakan agen etiologi dari infeksi termasuk mikositosis yang berhubungan dengan aflotoksin, pneumonitis hipersensitif, dan penyakit invasif.

Mikroskopik Aspergillus flavus

 Aspergilus niger

Makroskopik

Pada medium PDA dengan suhu 25oC berwarna putih, cepat berubah menjadi hitam dengan produksi konidium.

Makroskopik Aspergillus niger

Mikroskopik

Hifa Aspergilus niger berupa septa dan hialin. Kepala konidia terlihat bersinar, terpisah menjadi kolum-kolum. Konidia panjang 300-400 µm, halus dan hialin menjadi lebih gelap pada apeks. Konidia berwarna coklat kehitaman, sangat kasar dan berdiameter 4-5 µm.

Mikroskopik Aspergillus niger

 Aspergillus fumigatus

Makroskopik

Koloni pada medium PDA pada suhu 25oC berwarna abu-abu kehijauan terlihat seperti berasap. Beberapa isolasi mungkin terlihat seperti pigmen lavender. Koloni yang sangat matur berubah menjadi abu-abu batu. Teksturnya seperti benang wol atau kapas dan granular.

Makroskopik Aspergillus fumigatus

Mikroskopik

Hifa Aspergillus fumigatus berupa septa dan hialin. Kepala konidia terlihat seperti kolumnar keras. Konidiospora terlihat lembut, tidak berwarna dengan panjang 300 µm, dan berbentuk seperti kubah dengan diameter 20-30 µm, konidia bisa halus sampai kasar dengan diameter 2-3,5 µm.

Mikroskopik Aspergillus fumigatus

• Isolasi Cryptococcus neoformans

Sampel

- Sampel diambil secara aseptis sebelum pemberian antifungal, dikumpulkan pada wadah yang steril dan segera dibawa ke laboratorium

- Sampel diambil sesegera mungkin setelah timbulnya gejala yang mendukung ke arah diagnosis

- Jumlah sampel yang dianjurkan untuk cairan serebrospinal (CSS) adalah > 2 mL. Sampel darah 10-20 mL untuk dewasa dan 4-10 mL untuk anak-anak

Pemeriksaan langsung

Metode yang digunakan untuk pemeriksaan mikroskopis langsung adalah pewarnaan dengan tinta India dan dibaca dengan mikroskop cahaya, merupakan pemeriksaan yang dilakukan untuk mendeteksi kapsul sel fungi C. neoformans.

Deteksi Antigen C. neoformans dengan Aglutinasi Lateks

Prinsip Pemeriksaan Partikel lateks yang dilapisi dengan anticryptococcal globulin reagent (ACGR) akan bereaksi dengan antigen Cryptococcus dalam serum atau cairan serebrospinal pasien. Apabila terdapat antigen Cryptococcus dalam sampel yang diperiksa maka akan terbentuk/terlihat aglutinasi.

Pemeriksaan Berdasarkan Metode Enzyme Immunoassay

Penelitian klinis menunjukkan bahwa enzyme immunoassay digunakan sebagai metode pendukung untuk pengukuran antibodi IgG pada kriptokokosis. Literatur menyatakan metode untuk mendeteksi antibodi Cryptococcus yang ada sekarang kurang spesifik dan kurang sensitif. Tes aglutinasi tabung mendeteksi hanya 30% pasien dengan Cryptococcus, immunofluorescence assay (IFA) mendeteksi kira-kira 38% kasus dengan Cryptococcus. Gabungan kedua pemeriksaan tersebut direkomendasikan dengan kemampuan mendeteksi kira-kira 50% kasus kriptokokosis.

Kultur Cryptococcus neofarmans

Diagnosis kriptokokosis dikonfirmasi dengan melakukan kultur organisme yang merupakan baku emas dalam diagnosis laboratorium. Media yang paling umum digunakan untuk kultur fungi adalah Sabouraud Dextrose Agar (SDA). Sabouraud Dextrose Agar digunakan untuk isolasi dan penanaman fungi.

Metode Secara Molekular

Pendekatan diagnostik secara molekular yaitu deteksi DNA dengan amplifikasi secara Polymerase Chain Reaction (PCR) dan amplifikasi hasil PCR dideteksi secara elektroforesis.

• Identifikasi Cryptococcus neoformans

Makroskopik

Cryptococcus neoformans adalah organisme dimorfik, merupakan basidiomisetes yang bersifat saprofit, ditemukan di seluruh dunia karena habitatnya adalah pada kotoran burung dan tanah yang terkontaminasi kotoran burung.

Pada medium SDA dengan suhu kamar, koloni yang terbentuk berwarna kecoklatan, mengkilat, dan mukoid, sedangkan Kultur pada Birdseed (NIGER) Agar menghasilkan warna coklat gelap.

Makroskopik Cryptococcus neoformans

Mikroskopik

Secara mikroskopis, dalam bahan kultur atau klinis, sel fungi yang bulat dan bertunas (diameter 5-10 mikron) dikelilingi oleh kapsul tebal yang tidak terwarnai, maka di amati dengan tinta india. Basidiospora berukuran kecil yaitu 1,8 µm sampai 3,0 µm, dapat dalam bentuk sel ragi pada suhu 37°C atau membentuk hifa dikariotik pada suhu 25°C.

• Isolasi Mucor sp.

Sampel

Kerokan kulit dari lesi kulit, dahak dan jarum biopsi dari lesi paru, hidung, kerokan dan aspirasi dari sinus pada pasien dengan lesi rhinocerebral dan jaringan biopsi dari pasien dengan gastrointestinal.

Kultur Isolasi

Menggunakan media SDA. Kebanyakan Zygomycetes sensitif terhadap cycloheximide (actidione) dan agen ini tidak boleh digunakan dalam media kultur.

Serologi

Saat ini tidak ada prosedur serologis yang tersedia secara komersial untuk diagnosis zygomycosis. Meskipun beberapa laboratorium telah mengembangkan tes ELISA untuk mendeteksi antibodi terhadap Zygomycetes.

• Identifikasi Mucor sp

Makroskopis

Zygomycetes biasanya tumbuh dengan cepat, ditandai dengan coenocytic (kebanyakan bersekat) hifa tumbuh. spora aseksual termasuk chlamydoconidia, konidia dan sporangiospores terkandung dalam sporangia ditanggung pada sporangiospora sederhana atau bercabang. reproduksi seksual adalah isogamous menghasilkan beristirahat seksual spora berdinding tebal disebut Zygosporea.

Mikroskop Langsung

Kerokan, dahak dan eksudat harus diperiksa menggunakan KOH 10% & tinta Parker atau Calcofluor gunung.

Mikroskopik Mucor sp.

DAFTAR PUSTAKA

Jawetz, Melnick dan Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Ellis, David. Dkk. 2007. Descriptions Of Medical Fungi. Second Edition. Australia : School Of Molecular & Biomedical Science University Of Adelaide.

Haza Annisa, Gisela. 2012. Karakteristik Klinis dan Laboratorium Mikologi Pada Pasien Tersangka Mikosis Paru Di Rumah Sakit Persahabatan. Jakarta. Skripsi Universitas Indonesia

Efrida, Desiekawati. 2012. Kriptokokal Meningitis : Aspek dan Diagnosis Laboratorium. Jurnal Kesehatan Andalas. Vol 1. No 1. Halaman 39-44.

http://www.microbiologybook.org/mycology/opportunistic.htm (diakses pada tanggal 12 Maret 2018)

https://mycology.adelaide.edu.au/mycoses/opportunistic/ (diakses pada tanggal 23 Maret 2018)