Metode Isolasi dan Amplifikasi untuk Produksi Phytase Menggunakan Bacillus sp

Oleh: Novi Mayasari dan Diyn Aldida Syifa

Latar Belakang:

Enzim phytase adalah enzim penting dalam bidang nutrisi hewan, terutama bagi spesies non-ruminansia seperti unggas dan babi. Phytase berfungsi untuk memecah asam fitat, bentuk utama penyimpanan fosfor dalam biji-bijian, sehingga meningkatkan ketersediaan fosfor dan mineral esensial lainnya seperti kalsium, besi, dan seng bagi hewan. Di alam, beberapa mikroorganisme, termasuk Bacillus, memiliki kemampuan untuk memproduksi enzim phytase secara alami.

Bacillus adalah salah satu mikroorganisme yang paling banyak digunakan dalam industri karena sifatnya yang mudah diisolasi, kemampuan produksinya yang tinggi, serta stabilitas termal yang baik. Oleh karena itu, penelitian tentang metode produksi enzim phytase dari Bacillus semakin meningkat dengan tujuan mengurangi kebutuhan suplemen fosfor anorganik dalam pakan, menurunkan biaya pakan, serta mengurangi dampak lingkungan.

Isu:

Saat ini, salah satu isu yang dihadapi dalam produksi phytase adalah metode yang efisien untuk menghasilkan enzim dalam jumlah besar dengan aktivitas yang tinggi dan stabil. Produksi komersial membutuhkan optimasi berbagai kondisi, seperti suhu, pH, substrat, serta teknik isolasi yang dapat memastikan yield yang tinggi dari enzim. Selain itu, pemilihan strain Bacillus yang tepat juga menjadi faktor penting karena tidak semua strain memiliki kemampuan produksi phytase yang sama.

Tahapan Pembuatan Enzim Phytase Menggunakan Bacillus:

1. Isolasi Strain Bacillus Penghasil Phytase:

Strain Bacillus diisolasi dari lingkungan seperti tanah, limbah, atau sumber alami lainnya. Setelah isolasi, dilakukan identifikasi strain menggunakan metode biokimia atau teknik molekuler seperti sekuensing 16S rRNA untuk memastikan spesies yang digunakan adalah Bacillus subtilis atau Bacillus licheniformis, yang diketahui mampu menghasilkan phytase.

2. Persiapan Media dan Kultur:

Strain yang terpilih dikultur dalam media pertumbuhan yang sesuai, seperti Nutrient Broth (NB) atau Luria-Bertani (LB) broth, dengan penambahan sumber karbon dan nitrogen untuk merangsang pertumbuhan bakteri. Untuk produksi phytase, media sering kali diperkaya dengan inositol atau natrium fitat sebagai substrat induksi.

3. Fermentasi:

Kultur dilakukan dalam kondisi aerobik dengan pengaturan suhu dan pH yang tepat. Biasanya, suhu optimal untuk produksi phytase oleh Bacillus berkisar antara 30°C hingga 37°C, dengan pH optimal di sekitar 6.5-7. Fermentasi berlangsung selama 24-48 jam, tergantung pada pertumbuhan bakteri dan produksi enzim.

4. Isolasi dan Purifikasi Phytase:

Setelah fermentasi, kultur disentrifugasi untuk memisahkan sel dari media. Supernatan yang mengandung enzim phytase diambil, kemudian enzim diendapkan menggunakan teknik seperti presipitasi amonium sulfat. Purifikasi lebih lanjut dilakukan dengan metode kromatografi, seperti kromatografi gel filtrasi atau pertukaran ion.

5. Pengujian Aktivitas Phytase:

Aktivitas enzim phytase diuji menggunakan metode spektrofotometri dengan mengukur pelepasan fosfor anorganik dari natrium fitat. Unit aktivitas phytase dihitung berdasarkan jumlah fosfor yang dilepaskan per menit per miligram protein.

Alat dan Bahan:

1. Alat:

Inkubator, autoklaf, sentrifuge, spektrofotometer, pipet mikro, alat kromatografi, dan alat PCR untuk verifikasi gen.

2. Bahan:

Nutrient Broth/LB broth, natrium fitat, larutan amonium sulfat, buffer fosfat, dNTP, Taq polimerase, primer spesifik gen phytase, kit isolasi DNA, dan media kromatografi.

Metode Isolasi Genom dan Amplifikasi Gen Phytase Menggunakan PCR

1. Metode Isolasi Genom

Tujuan dari isolasi genom adalah untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi yang akan digunakan dalam amplifikasi gen phytase. Dalam proses ini, genom bakteri seperti Bacillus diisolasi menggunakan teknik fisik dan kimiawi yang bertujuan untuk menghancurkan dinding sel tanpa merusak DNA.

(Sumber: Dokumentasi pribadi)

Tahapan Isolasi Genom:

1. Lisis Sel:

• Bakteri Bacillus yang telah dikulturkan dipanen dan disentrifugasi untuk memisahkan sel dari media kultur.

• Sel-sel tersebut kemudian diresuspensi dalam buffer lisis yang mengandung enzim lisozim untuk menghidrolisis dinding sel bakteri. Langkah ini dilakukan untuk memecah dinding sel dan melepaskan isi sel.

2. Penambahan Proteinase K dan Detergen:

• Proteinase K digunakan untuk mendegradasi protein yang berikatan dengan DNA, sementara detergen (seperti SDS) membantu melisiskan membran sel dan melepaskan DNA dari kompleks protein.

3. Ekstraksi DNA:

• Setelah lisis, campuran diekstraksi menggunakan fenol-kloroform atau metode kit komersial. Metode ini memisahkan fase air yang mengandung DNA dari fase organik yang mengandung protein dan lipid.

4. Presipitasi DNA:

• DNA dalam fase air dipresipitasi dengan penambahan alkohol dingin (etanol atau isopropanol) dan garam (seperti natrium asetat). DNA yang terpresipitasi kemudian disentrifugasi dan dicuci dengan etanol 70%.

• Menurut Syifa et al., (2023), konsentrasi DNA hasil isolasi genom dari sumber gen Bacillus yaitu 115,5 ng/μL (Bacillus cereus), 208,2 ng/μL (Bacillus licheniformis), 69,1 ng/μL (Bacillus sp 6 yang berasal dari tauco), 184,1 ng/μL (Bacillus sp 7 yang berasal dari batu).

5. Pengujian Kualitas dan Kuantitas DNA:

• Setelah proses isolasi, DNA dilarutkan dalam buffer TE atau air bebas DNase. Kemurnian DNA diuji dengan spektrofotometer untuk mengukur rasio A260/A280. Rasio 1.8–2.0 menunjukkan DNA murni.

6. Penyimpanan DNA:

• DNA genomik disimpan pada suhu -20°C hingga siap digunakan dalam proses amplifikasi.

3. Metode Amplifikasi dengan PCR

(Sumber gambar: Wikipedia)

Tujuan amplifikasi menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah untuk memperbanyak fragmen gen yang mengkodekan phytase dari DNA genomik Bacillus. PCR adalah teknik yang memungkinkan penggandaan jutaan salinan fragmen DNA tertentu dalam waktu singkat.

Tahapan PCR:

1. Desain Primer:

• Primer spesifik untuk gen phytase (phy) didesain dengan menggunakan urutan gen target dari Bacillus. Panjang primer biasanya antara 18-30 basa, dengan kandungan GC sekitar 40-60% untuk memastikan stabilitas dan efisiensi dalam amplifikasi.

• Berdasarkan hasil penelitian Syifa et al., (2023), konsentrasi primer sebesar 0,4 μM/μL mampu mengamplifikasi gen phy dan konsentrasi template DNA yang bervariasi (200-400 ng/μL) dapat menghasilkan pita (band) DNA dengan optimal untuk digunakan dalam amplifikasi gen phy pada Bacillus sp.

2. Persiapan Reaksi PCR:

Komponen reaksi PCR meliputi:

- DNA template: DNA genomik hasil isolasi dari Bacillus.

- Primer forward dan reverse (spesifik untuk gen phytase).

- dNTP (nukleotida bebas untuk sintesis DNA).

- Buffer PCR yang mengandung MgCl2 untuk stabilitas reaksi.

- DNA polymerase (Taq polymerase) yang tahan panas untuk memperpanjang rantai DNA.

3. Protokol PCR:

Reaksi PCR melibatkan siklus pengulangan tiga tahap utama:

• Denaturasi awal: Sampel dipanaskan pada suhu 94-95°C selama 2-5 menit untuk memisahkan untai ganda DNA menjadi untai tunggal.

• Denaturasi: Pemanasan pada suhu 94-95°C selama 30 detik untuk memisahkan untaian DNA.

• Annealing: Suhu diturunkan sesuai dengan suhu Tm primer (biasanya 50-60°C) selama 30 detik untuk memungkinkan primer menempel pada DNA template.

• Elongasi: Suhu dinaikkan ke 72°C selama 1-2 menit untuk memperpanjang rantai DNA dengan bantuan Taq polymerase.

• Final Elongation: Pada suhu 72°C selama 5-10 menit untuk memastikan semua fragmen DNA disintesis sepenuhnya.

• Proses ini biasanya berlangsung dalam 30-35 siklus.

(Sumber: Andy Vierstraete, 1999)

Pada penelitian Syifa et al., (2023), suhu annealing yang dapat digunakan untuk Bacillus licheniformis yaitu berada pada rentang suhu 54-56°C. Untuk Bacillus sp 6 dan Bacillus sp 7 Ta yang digunakan bervariasi dengan suhu optimum masing-masing yaitu 54,98°C dan 56,42°C.

4. Elektroforesis Gel:

• Hasil amplifikasi kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1%. DNA yang teramplifikasi akan terlihat sebagai pita pada gel setelah pewarnaan dengan etidium bromida dan visualisasi di bawah sinar UV.

(Sumber: Dokumentasi pribadi Bacillus sp.)

5. Konfirmasi Urutan Gen:

• Setelah amplifikasi, fragmen DNA dapat dipurifikasi dan diurutkan (sequencing) untuk mengkonfirmasi bahwa amplifikasi berhasil dan urutan yang diperoleh adalah gen phytase yang diinginkan.

Kesimpulan:

Pembuatan enzim phytase menggunakan Bacillus adalah proses yang melibatkan beberapa tahapan penting, mulai dari isolasi strain yang tepat hingga optimasi kondisi fermentasi. Penggunaan Bacillus sebagai sumber enzim phytase memiliki potensi besar karena kestabilan termal yang tinggi dan kemampuannya untuk diproduksi dalam skala besar. Dengan optimasi proses fermentasi dan purifikasi, enzim phytase dapat dihasilkan dalam jumlah besar untuk aplikasi dalam pakan ternak, yang pada akhirnya dapat meningkatkan efisiensi pakan dan mengurangi ekskresi fosfor ke lingkungan.

Metode isolasi genom dan amplifikasi PCR dari Bacillus memungkinkan diperolehnya fragmen gen phy yang mengkodekan enzim phytase. Dengan teknik PCR yang tepat, gen ini dapat diperbanyak secara efisien, yang menjadi dasar dalam aplikasi rekayasa genetik dan produksi enzim phytase untuk pakan ternak.

Optimasi:

Suhu optimal untuk produksi phytase adalah 37°C, dengan pH media sekitar 6.5-7. Penggunaan substrat seperti natrium fitat dalam fermentasi dapat meningkatkan yield enzim. Produksi maksimal dicapai setelah 48 jam fermentasi.

Referensi:

Syifa DA, Widyastuti Y, Herlina N, Hasbuna A, Al Islahi ASH, Triratna L, Mayasari N: Isolation and amplification of the phy gene coding phytase from Bacillus sp. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 29 (6): 659-663, 2023. DOI: 10.9775/kvfd.2023.30163